Гибридизация ДНК: понятие, определение, этапы развития и применение

Метод FISH используют в преимплантационной, пренатальной и постнатальной генетической диагностике[1], в диагностике онкологических заболеваний[2], в ретроспективной биологической дозиметрии[3].

Иммуногистохимическое исследование (ИГХ)

Иммуногистохимия является дополнительным методом исследования, применяемым в патологической анатомии при диагностике доброкачественных и злокачественных новообразований, когда постановка диагноза по гистологическим препаратам не представляется возможной или требуется уточнение клинически важных молекулярных параметров опухоли.

Данная методика основана на выявлении в анализируемом образце ткани белков, специфичных для того или иного вида клеток, что позволяет отличать один вид опухоли от другого, а также выявлять маркеры, отвечающие за лекарственную чувствительность опухолевой ткани.

Зачем нужна иммуногистохимия, если уже сделано гистологическое исследование?

В ряде случаев проведения обычного гистологического исследования биопсии бывает недостаточно, что объясняется следующими причинами:

  • опухоль имеет крайне неспецифичное микроскопическое строение, которое не позволяет поставить окончательный диагноз.

Например, диагноз практически всех лимфом и лейкозов (более 70 видов!) ставится после ИГХ исследования, а в части случаев дополнительно требуется молекулярно-генетическое исследование; в свою очередь, за гистологическим диагнозом «мелкокруглоклеточная опухоль» может скрываться до 13 различных злокачественных опухолей, каждая из которых имеет свой прогноз и требует индивидуального плана химиолучевого лечения – единственным методом, способным помочь врачу в дифференцировании этой группы опухолей, является ИГХ исследование.

Сроки выполнения ИГХ исследования

В соответствии с Приказа №179н от г. Минздрава России, срок выполнения ИГХ исследования:

  • с использованием до 5 маркеров включительно – не более 7 рабочих дней,
  • с использованием более 5 маркеров – не более 15 рабочих дней.

Возможности ИГХ исследования

Иммуногистохимическое исследование (ИГХ)

1. Диагностика:

  • окончательное (реже промежуточное) установление диагноза опухолевого процесса (различные варианты рака, саркомы мягких тканей, меланома, типирование лимфом и лейкозов),
  • уточнение степени злокачественности опухоли (напр., нейроэндокринной опухоли), что будет определять прогноз заболевания,
  • дифференциальная диагностика опухолей и неопухолевых процессов,
  • определение органной принадлежности метастаза с неизвестной первичной локализацией (применимо не для всех опухолей!),
  • дифференцирование множественных опухолевых процессов (наличие у пациента 2 и более разных опухолей).

2. Лекарственная чувствительность

  • рецепторы стероидных гормонов (рецепторы эстрогенов, рецепторы прогестерона, рецепторы андрогенов) – рак молочной железы, рак тела матки (эндометрия), другие опухоли;
  • белок Her2/neu — рак молочной железы, рак желудка, рак мочевого пузыря;
  • рецепторы соматостатина 2А и 5 типов – нейроэндокринные опухоли (карциноиды);
  • PD-L1 – немелкоклеточный рак легкого, беспигментная меланома, другие опухоли;
  • ALK — немелкоклеточный рак легкого;
  • ROS1 — немелкоклеточный рак легкого;
  • микросателлитная нестабильность (MSI) – рак толстой кишки, другие опухоли;
  • индекс пролиферативной активности (Ki-67) – различные виды злокачественных опухолей.

Пациенты, не находящиеся на госпитализации в стационарах НМИЦ онкологии, могут узнать о стоимости ИГХ исследования в регистратуре патологоанатомического отделения (4 этаж, каб. №12).

Если у меня есть полис ОМС, должен ли я платить за иммуногистохимическое исследование?

Для всех пациентов, находящихся на госпитализации в стационарах НМИЦ онкологии и получающих медицинскую помощью по ОМС или ВМП (высокотехнологичная медицинская помощью), ИГХ исследование выполняется бесплатно. Необходимым условием выполнения бесплатного исследования является нахождение пациента на госпитализации в стационаре на момент оформления ИГХ.

Читайте также:  Болит десна возле зуба мудрости: что делать

Во всех остальных случаях ИГХ исследование выполняется засчет личных средств пациента.

За более подробной информацией рекомендуем обращаться в вашу страховую компанию.

ЧИТАЙТЕ ЕЩЕ ПО ТЕМЕ:

  1. Пересадка костного мозга как происходит
  2. Вирус папилломы человека что это
  3. Где находятся лимфоузлы у человека на шее
  4. На шее воспалился лимфоузел что делать
  5. Как быстро развивается рак молочной железы
  6. Как лечат рак груди
  7. Онкомаркеры са 15 3 что это такое
  8. Фиброаденома молочной железы что это
  9. Что такое игх исследование в онкологии

Процедура гибридизации

Схема эксперимента по флуоресцентной гибридизации in situ для локализации положения гена в ядре

На первом этапе происходит конструирование зондов. Размер зонда должен быть достаточно большим для того, чтобы гибридизация происходила по специфическому сайту, но и не слишком большой (не более 1 тыс. п. о.), чтобы не препятствовать процессу гибридизации. При выявлении специфических локусов или при окраске целых хромосом надо заблокировать гибридизацию ДНК-проб с неуникальными повторяющимися ДНК-последовательностями путём добавления в гибридизационную смесь немеченой ДНК повторов (например, Cot-1 DNA). Если ДНК-зонд представляет собой двуцепочечную ДНК, то перед гибридизацией её необходимо денатурировать.

На следующем этапе приготавливают препараты интерфазных ядер или метафазных хромосом. Клетки фиксируют на субстрате, как правило, на предметном стекле, затем проводят денатурацию ДНК. Для сохранения морфологии хромосом или ядер денатурацию проводят в присутствии формамида, что позволяет снизить температуру денатурации до 70 °C.

Далее к препарату добавляют зонды и осуществляют гибридизацию около 12 часов. Затем проводят несколько стадий отмывок для удаления всех негибридизовавшихся зондов.

Визуализацию связавшихся ДНК-зондов проводят при помощи флуоресцентного микроскопа. Интенсивность флуоресцентного сигнала зависит от многих факторов — эффективности мечения зондом, типа зонда и типа флуоресцентного красителя.

Подготовка и проведение процедуры

Забор крови на анализ проводится по стандартной схеме. Для анализа понадобится венозная кровь, которая в дальнейшем отправляется в лабораторию и исследуется при помощи анализатора.

Важно! Благодаря новейшей медицинской технике результаты можно узнать через считанные минуты. Но многие лаборатории имеют возможность выдавать данные только через 1-2 дня.

Стандартизованная операционная процедура (СОП) определяет порядок выполнения иммунохимического анализа крови.

Подготовка и проведение процедуры

Особой подготовки к проведению процедуры не нужно, но имеется ряд правил, благодаря которым можно получить наиболее достоверный результат:

  1. Сдавать кровь нужно утром натощак.
  2. Допустимо выпить стакан негазированной воды, но есть запрещено.
  3. Крайний прием пищи осуществляется вечером, до 21 часа.
  4. За двое суток до обследования стоит ограничить себя в употреблении жирной и белковой пищи. Эти вещества (жир и белок) увеличивают свертываемость крови, и она становится мутной. А это обстоятельство искажает правильность результатов обследования.
  5. За 2-3 дня до сдачи анализа также запрещено употреблять алкогольные напитки, они влияют на большинство показателей исследования, в том числе на гормоны.
  6. За день до иммунохимического анализа нельзя курить. Если человеку трудно это сделать заранее, то нужно отказаться от сигарет хотя бы за два часа до похода в лабораторию.
  7. Женщинам стоит знать, что уровень половых гормонов в различные фазы цикла меняется, поэтому обязательно следует сообщить врачу о том, когда в последний раз была менструация. При беременности учитывается срок и триместр.
  8. Врачи рекомендуют временно приостановить прием лекарственных средств. Обычно это делается за неделю-полторы до сдачи анализа. Если такой возможности нет, то при расшифровке анализа стоит учитывать наличие в крови какого-либо лекарства.
  9. Кровь нельзя сдавать сразу после физической активности или психологического напряжения. Уже с вечера до анализа следует воздержаться от физического и эмоционального напряжения. Перед прохождением исследования стоит успокоиться, привести себя в норму, обычно на это уходит 20-25 минут, и только потом можно отправляться в кабинет врача.
Читайте также:  Острый апикальный периодонтит. Что это и как лечится?

В некоторых случаях назначается иммунохимический анализ кала на скрытую кровь.

Она выделяется при некоторых патологиях, например, при диагностике рака прямой кишки, полипов или эрозии в слизистой кишечника. Подготовка в этом случае будет стандартная, как и при обычном анализе кала.

Если берется кровь на прогестерон, то ее сдают на 22-й или 23-й день после начала менструации.

При этом накануне анализа исключаются:

Подготовка и проведение процедуры
  1. Стрессовые состояния.
  2. Спиртные напитки.
  3. Курение.
  4. Жирные блюда.

Внимание! Также в некоторых лабораториях принимают мочу на анализ иммунитета. Он может выявить наличие паразитарной инфекции, наличие большого количества гормонов при беременности и т.д.

Как обрабатывают эти материалы для проведения гистологического исследования?

1 Этап. Фиксация — «консервирование» биоптата в формалине — специальном химическом растворе, который предотвращает гниение, позволяет сохранить структуры ткани.

Фиксация биоптата может занимать от 6 до 24 часов – в зависимости от его вида и размера.

Операционный материал фиксируется дольше, в несколько этапов. Сначала предварительная фиксация, которая занимает примерно 12 часов. Затем вырезка нужных фрагментов и повторная фиксация еще 24 часа.

Соотношение объема материала к объему формалина должно быть 1:20.

Время фиксации сократить нельзя!

2 Этап. Процессинг — процесс обезвоживания, обезжиривания и пропитки материала парафином. Автомат перемещает кусочек материала из раствора в раствор.

В качестве растворов применяются: абсолютированный изопропиловый спирт (6-8 смен), ксилол (2 смены), расплавленный парафин (2 смены).

Программа разнится для «жирного» материала (к которым относятся, например, ткани молочной железы) и «нежирного» – 36 и 24 часа соответственно.

Процесс получения парафиновых блоков.

3 Этап. Изготовление парафинового блока. Кусок материала помещается в форму с расплавленным парафином (уже другим нежели во время процессинга – с более высокой температурой плавления) и охлаждается. Выполняется вручную, сложно ускорить.

Микротомия

4 Этап. Изготовление срезов. Толщина образца — кусочка ткани, залитого в парафин – 1-3 мм. Толщина каждого среза 4-5 мкм (0,004-0,005 мм). Выполняет лаборант с использованием специального инструмента – микротома.

Срезы монтируются на стекла и должны высохнуть.

Несмотря на то, что часть материала теряется при выравнивании в микротоме, при должном профессионализме, из одного образца — материала от одной биопсии, операционного материала от одной опухоли, возможно изготовить около 100 стекол (микропрепаратов).

Для чего делаются срезы?

Срезы делаются для рутинной окраски гематоксилинном и эозином, иммуногистохимического исследования и других видов исследований.

Срезы для всех исследований используются одинаковые, различается окраска, могут отличаться стекла, на которые они монтируются, так для ИГХ и FISH нужны специальные адгезивные стекла или заряженные стекла.

Гистостейнер

Блоки и стекла способны храниться долгие годы и использоваться для проведения дополнительных гистологических исследований, пересмотров, а также в научных целях.

Архив

Архив гистологических материалов собирается в НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова с 1927 года и содержит более 10 млн единиц хранения (микропрепараты — стекла, парафиновые блоки, архивные карточки, влажный архив).

Методология

ДНК одного организма метили, затем смешивали с не меченной ДНК, которую можно было сравнить с ней. Смесь инкубируют, чтобы позволить цепям ДНК диссоциировать и затем охлаждаться с образованием возобновленной гибридной двухцепочечной ДНК. Гибридизированные последовательности с высокой степенью сходства будут более жестко связываться и требуют больше энергии для их разделения: т. е. они разделяются при нагревании при более высокой температуре, чем разнородные последовательности, процесс, известный как «плавление ДНК».

Лечение

Лечение рака молочной железы in situ будет зависеть от локализации новообразования, его размеров, наличия одной или нескольких пораженных областей, общего состояния здоровья пациентки, наличия опасных онкологических факторов.

В случае дольковой карциномы оперативное вмешательство может не понадобиться. Пациентке необходимо будет только регулярно посещать врача для наблюдения за патологией в динамике. В случае гормон-рецептор-положительной карциномы назначают гормональные препараты, которые связываются с рецепторами раковых клеток и препятствуют их взаимодействию с женскими половыми гормонами. Таким образом можно тормозить развитие раковой опухоли.

При протоковой карциноме обычно рекомендуют хирургическое лечение. Оно может включать резекцию только пораженной области или тотальную мастэктомию. Операция позволяет значительно снизить риск развития инвазивного рака в будущем. Тотальная мастэктомия рекомендуется, если:

  • Присутствует несколько протоковых карцином;
  • Ранее уже проводилось оперативное вмешательство в этой области, однако раковые клетки все равно обнаруживаются;
  • Протоковая карцинома начинает прорастать в соседние ткани.

При наличии показаний дополнительно может потребоваться радиотерапия.

Археология [ править | править код ]

В археологии, in situ

обозначается артефакт, который не был перемещен со своего изначального места расположения. Артефактin situ важен для интерпретации самого себя и, следовательно, для культуры, в которой он был сформирован. Как только изначальное местоположение арфтефакта было зафиксировано, он может быть перемещен для сохранения, дальнейшей интерпретации и демонстрации. Артефакт, найденный неin situ, не может рассматриваться в контексте и, следовательно, не предоставляет точной картины соответствующей культуры. Однако такой артефакт может представлять для учёных пример артефактовin situ , которые ещё не были найдены, а также намекать на их расположение. Во время раскопки захоронений,in situ означает, что составление каталогов, запись, картографирование и фотографирование человеческих останков происходит в том месте, где они были найдены.

Метка in situ

всего лишь означает, что объект не был перемещен «недавно». Таким образом, археологическая находкаin situ может быть исторически перенесена из другого места, быть «добычей» на войне в прошлом, быть объектом торговли или какого-либо ещё инородного происхождения. Следовательно, даже если объект найден «на месте», это место не может раскрыть его провенанс, но с последующим расследованием может помочь обнаружить такие связи, которые в противном случае остались бы неизвестными.

Археологические слои могут быть разработаны как специально, так и случайно (человеком, животным или в результате действия природной стихии). Примером могут служить курганы, где горизонтальные или вообще схожие слои совершенно нетипичны, или земли, очищенные и распаханные для земледелия.

Термин in situ

также часто используется для обозначения древних скульптур, вырезанных в таком месте, как Сфинкс или Петра. Это отличает их от статуй, которые были вырезаны и только затем перемещены как, например, Колоссы Мемнона, которые были перемещены ещё в древние времена.